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微流控芯片技術(shù)詳解_微流控技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

微流控芯片技術(shù)

 微流控芯片技術(shù)(Microfluidics)是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上, 自動(dòng)完成分析全過程。由于它在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的巨大潛力,已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料、機(jī)械等學(xué)科交叉的嶄新研究領(lǐng)域。

  本文首先介紹了微流控技術(shù)原理及微流控芯片的工作原理,其次詳細(xì)的闡述了微流控芯片技術(shù),最后介紹了微流控技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。

微流控技術(shù)原理

  微流控(microfluidics )是一種精確控制和操控微尺度流體,以在微納米尺度空間中對流體進(jìn)行操控為主要特征的科學(xué)技術(shù),具有將生物、化學(xué)等實(shí)驗(yàn)室的基本功能諸如樣品制備、反應(yīng)、分離和檢測等縮微到一個(gè)幾平方厘米芯片上的能力,其基本特征和最大優(yōu)勢是多種單元技術(shù)在整體可控的微小平臺上靈活組合、規(guī)模集成。是一個(gè)涉及了工程學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、微加工和生物工程等領(lǐng)域的交叉學(xué)科。

  微流控是系統(tǒng)的科學(xué)技術(shù),它使用幾十到幾百微米尺度的管道,處理或操控很少量的(10*至10~18升,1立方毫米至1立方微米) 流體。最初的微流控技術(shù)被用于分析。微流控為分析提供了許多有用的功能:使用非常少的樣本和試劑做出高精度和高敏感度的分離和檢測,費(fèi)用低,分析時(shí)間短,分析設(shè)備的印記小。微流控既利用了它最明顯的特征一一尺寸小,也利用了不太明顯的微通道流體的特點(diǎn),比如層流。它本質(zhì)上提供了在空間和時(shí)間上集中控制分子的能力。


微流控芯片的工作原理

 微流控芯片采用類似半導(dǎo)體的微機(jī)電加工技術(shù)在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng),將實(shí)驗(yàn)與分析過程轉(zhuǎn)載到由彼此聯(lián)系的路徑和液相小室組成的芯片結(jié)構(gòu)上,加載生物樣品和反應(yīng)液后,采用微機(jī)械泵。電水力泵和電滲流等方法驅(qū)動(dòng)芯片中緩沖液的流動(dòng),形成微流路,于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng)。激光誘導(dǎo)熒光、電化學(xué)和化學(xué)等多種檢測系統(tǒng)以及與質(zhì)譜等分析手段結(jié)合的很多檢測手段已經(jīng)被用在微流控芯片中,對樣品進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和高通量分析。微流控芯片的最大特點(diǎn)是在一個(gè)芯片上可以形成多功能集成體系和數(shù)目眾多的復(fù)合體系的微全分析系統(tǒng)?微型反應(yīng)器是芯片實(shí)驗(yàn)室中常用的用于生物化學(xué)反應(yīng)的結(jié)構(gòu),如毛細(xì)管電泳、聚合酶鏈反應(yīng)、酶反應(yīng)和DNA 雜交反應(yīng)的微型反應(yīng)器等。其中電壓驅(qū)動(dòng)的毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis,CE) 比較容易在微流控芯片上實(shí)現(xiàn),因而成為其中發(fā)展最快的技術(shù)。它是在芯片上蝕刻毛細(xì)管通道,在電滲流的作用下樣品液在通道中泳動(dòng),完成對樣品的檢測分析,如果在芯片上構(gòu)建毛細(xì)管陣列,可在數(shù)分鐘內(nèi)完成對數(shù)百種樣品的平行分析。


微流控芯片技術(shù)詳解

 1、微流控芯片的基質(zhì)材料

  基質(zhì)材料是微流控芯片的載體,在微流控芯片發(fā)展的初期,硅材料作為構(gòu)建微流控芯片的首選材料而被廣泛使用,這主要?dú)w因于業(yè)已成熟的半導(dǎo)體技術(shù)。但是隨著研究的不斷深入和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展,它表現(xiàn)出了不同程度的局限性:硅材料屬于半導(dǎo)體,不能承受高電壓,此外,硅材料不透明,與光學(xué)檢測技術(shù)不兼容。

  玻璃材料具有很好的電滲性質(zhì)和優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì),無論是從其物理性質(zhì)還是化學(xué)性質(zhì)來講,都非常適合于微流控芯片的制作,但是它的光刻和蝕刻技術(shù)工藝復(fù)雜、費(fèi)時(shí),制作成本過高,這些因素制約了玻璃微流控芯片的應(yīng)用和推廣。

  因此,研究者們開始把更多的注意力轉(zhuǎn)向了原材料便宜、加工制作簡單的高分子聚合物,目前,以聚二甲基硅氧烷(PolydiMethyl-Siloxane,PDMS)為代表的有機(jī)高分子聚合物已成為微流控芯片研究的熱點(diǎn),PDMS表現(xiàn)出了非常理想的材料特性:良好的絕緣性,能承受高電壓,已廣泛應(yīng)用于各種毛細(xì)管電泳微芯片的制作;熱穩(wěn)定性高,適合加工各種生化反應(yīng)芯片;具有很高的生物兼容性和氣體通透性,可以用于細(xì)胞培養(yǎng);同時(shí)具有優(yōu)良的光學(xué)特性,可應(yīng)用于多種光學(xué)檢測系統(tǒng);彈性模量低,適合于制作微流體控制器件,如泵膜等。此外,PDMS還可以和硅、氮化硅、氧化硅、玻璃等許多材料形成很好的密封。此外,較常用的高分子聚合物還包括聚甲基丙烯酸甲酯(PolyMethylMethAcrylate,PMMA)、聚碳酸酯(PolyCarbonate,PC)等。


 2、微流控芯片的加工技術(shù)

 微細(xì)加工技術(shù)是微流控芯片發(fā)展的前提條件,微流控芯片的制作技術(shù)首先起源于制造半導(dǎo)體及集成電路芯片所廣泛采用的光刻(Lithography)和蝕刻技術(shù)(Etching),目前已經(jīng)廣泛地用于硅片、玻璃和石英等基質(zhì)材料上微流體網(wǎng)絡(luò)的制作。其微制造工藝為:首先通過光學(xué)制板照相技術(shù)制備包括微流控芯片圖案的掩模,制備好的掩模通常是鍍有鉻層的石英玻璃板;然后用甩膠機(jī)均勻地在芯片表面涂敷一層光刻膠,在紫外光下進(jìn)行曝光,顯影。上述工作完成之后,用相應(yīng)的腐蝕劑對芯片進(jìn)行蝕刻,蝕刻完成后,去除剩余的光刻膠便可獲得所需的芯片微細(xì)結(jié)構(gòu)。該方法工藝周期長、制作成本高,但其微加工技術(shù)非常成熟。

  與硅片、玻璃材料不同的是,可用于微流控芯片加工制作的高分子聚合物種類繁多,而且各材料之間的物理化學(xué)性質(zhì)差別很大,所以它們的微加工技術(shù)表現(xiàn)出了一定的多樣性,目前主要有模塑法、熱壓法、LIGA技術(shù)、激光燒蝕技術(shù)和軟光刻法等。

  a、模塑法(InjecTIon Molding)

  是指通過光刻掩模技術(shù)制得凸起的微流控芯片陽模,然后在陽模上澆注液態(tài)的高分子聚合物,當(dāng)高分子聚合物完全固化后將其與陽模剝離即可得到具有微流體網(wǎng)絡(luò)的基片,適宜采用模塑法的高分子材料應(yīng)該具有很低的黏度和很低的固化溫度,如PDMS,環(huán)氧樹脂,聚四氟乙烯等材料。

  b、熱壓法

  也是一種需要陽模的微流控芯片制造技術(shù),該技術(shù)主要利用了高分子聚合物的玻璃轉(zhuǎn)化溫度。與模塑法相比,熱壓法制得的微通道重復(fù)性較差,而且管道易產(chǎn)生變形,操作條件相對苛刻。該方法主要應(yīng)用于熱塑性材料的加工,如PMMA和PC等。

  c、激光燒蝕(Laser AblaTIon)

  是一種新型的微細(xì)加工技術(shù),它是通過紫外激光降解高分子聚合物,適宜激光燒蝕加工的材料有PMMA、聚苯乙烯、硝化纖維等。

 3、微流控芯片的微流體控制技術(shù)

 微流體操縱技術(shù)是微流控芯片技術(shù)中最重要的一個(gè)研究領(lǐng)域之一,通過各種機(jī)械或非機(jī)械力實(shí)現(xiàn)對流體的驅(qū)動(dòng)和控制。依據(jù)微流體驅(qū)動(dòng)體系中有無機(jī)械活動(dòng)部件,可以將其分為機(jī)械和非機(jī)械驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)。

a、機(jī)械驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

 主要包括壓電微泵、靜電微泵等,它主要是通過靜電、壓電等不同方法來觸發(fā)引起的機(jī)械部件的運(yùn)動(dòng),從而為微流體提供動(dòng)力源,這種泵的優(yōu)點(diǎn)是任何流體都可以推動(dòng),但其所驅(qū)動(dòng)的流體呈脈沖狀而不是連續(xù)式的。

b、非機(jī)械驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

  主要包括電滲泵、熱毛細(xì)管泵等,其中電滲泵是微流控芯片系統(tǒng)中最常用的一種驅(qū)動(dòng)力,相對于微機(jī)械壓力驅(qū)動(dòng)的泵來說,電滲泵有很多優(yōu)點(diǎn):如電滲泵易于制作而且沒有任何移動(dòng)部件,電滲泵的樣品柱只有少量的擴(kuò)散,此外,可以采用改變微通道壁x(電勢)的方法來進(jìn)一步控制電滲流的量和方向。

  4、微流控芯片檢測技術(shù)


 微流控芯片的結(jié)構(gòu)特征決定了其檢測技術(shù)的特殊性,與傳統(tǒng)檢測儀器相比,微流控芯片對其檢測系統(tǒng)提出了更高的要求,如要求靈敏度高、響應(yīng)速度快、具有平行分析功能和便攜式特征等,目前基于不同原理的很多檢測技術(shù)都已經(jīng)應(yīng)用到微流控芯片的研究中,主要有光學(xué)檢測、電化學(xué)檢測、質(zhì)譜等方法。

a、光學(xué)檢測

  光學(xué)檢測是微流控芯片檢測方法中應(yīng)用最廣的一種,其優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng),且檢測器與分析對象不需直接接觸。其中激光誘導(dǎo)熒光檢測(Laser Induced Fluorescence,LIF)是目前最靈敏的檢測方法之一,其靈敏度達(dá)到10-9mol/L~10-12mol/L,對于某些熒光效率高的分子,其檢測能力可以達(dá)到單分子水平,因此它也是當(dāng)前商品化微流控系統(tǒng)中唯一被采用的檢測器。但該檢測設(shè)備價(jià)格昂貴,而且體積龐大,與微尺寸的微流控芯片極不匹配,一定程度上限制了其廣泛推廣與應(yīng)用。

b、電化學(xué)檢測

基于電化學(xué)檢測原理的檢測系統(tǒng)可以說是最完整的、最集成、最理想的芯片檢測系統(tǒng)之一,這主要有兩方面的原因:一方面,微電極的制造技術(shù)與當(dāng)前微流控芯片的加工工藝是完全兼容的,可以實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn);另一方面,電化學(xué)檢測具有靈敏度高、選擇性好、不受光程和樣品渾濁度影響等優(yōu)點(diǎn),且只需要極少的外圍輔助設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)快速檢測,圖1給出的是一種便攜式電化學(xué)檢測系統(tǒng)。無疑,基于電化學(xué)原理的芯片檢測技術(shù)代表未來芯片檢測器的一個(gè)重要發(fā)展方向,顯示了巨大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。

c、質(zhì)譜檢測

質(zhì)譜檢測技術(shù)作為生物化學(xué)分析的重要手段,由于能夠提供試樣組分中生物大分子的基本結(jié)構(gòu)和定量信息,所以在微流控芯片檢測器中表現(xiàn)出了巨大潛力,但當(dāng)前質(zhì)譜檢測的瓶頸在于質(zhì)譜儀與微流控芯片的接口問題。


流控技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用


 從微流控芯片的分析性能看,其未來的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑹謴V泛,并且其應(yīng)用領(lǐng)域仍在不斷地拓展之中,但目前的重點(diǎn)顯然是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。除此之外,高通量藥物合成與篩選、環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生、刑事科學(xué)及國防等方面也會成為重要的應(yīng)用領(lǐng)域。現(xiàn)僅就微流控芯片在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用舉三個(gè)例子說明微流控芯片系統(tǒng)的巨大潛力:

1、毛細(xì)管電泳分離

  毛細(xì)管電泳芯片是微流控芯片中發(fā)展最早、也是發(fā)展最快的一項(xiàng)芯片技術(shù),目前已經(jīng)成為微流控芯片領(lǐng)域中最令人矚目的一個(gè)分支。與傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳相比,它具有自動(dòng)化程度高、樣品消耗少、分析速度快以及高通量等特征,在對DNA片段、多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子的分析中,它表現(xiàn)出了超強(qiáng)的分離分析能力,它被認(rèn)為是后基因時(shí)代中最有希望攻克蛋白質(zhì)研究、基因臨床診斷等科學(xué)難題的分離分析手段之一。

  1992年Manz A發(fā)表了第一篇有關(guān)毛細(xì)管電泳芯片的論文,該文以熒光染料為分析對象,以電滲流作為流體驅(qū)動(dòng)力,在芯片微流體網(wǎng)絡(luò)中成功地實(shí)現(xiàn)了流體控制,向人們展示了毛細(xì)管電泳芯片的雛形和其優(yōu)越的分離分析能力,這一研究成果引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注和興趣,相繼各種用于氨基酸、蛋白質(zhì)、藥物等分離的芯片也不斷開發(fā)成功。為了進(jìn)一步提高芯片的分析能力,Mathies領(lǐng)導(dǎo)的研究小組最近在直徑為200mm的圓盤玻璃芯片上集成384個(gè)毛細(xì)管電泳微通道,其有效分離長度達(dá)到了8cm,對100bp(base pair,堿基對)~1000bp的基因標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物達(dá)到了優(yōu)于10bp的分辨率,并在該芯片上完成了1163D變異基因的PCR-RFLP(限制性片斷長度多態(tài)性)分析,為臨床診斷提供了依據(jù)。

  毛細(xì)管電泳微芯片是微流控分析芯片中產(chǎn)業(yè)化程度最高、也是最先實(shí)現(xiàn)商品化的一類芯片,早在1999年,美國惠普(現(xiàn)為安捷倫)與Caliper Tech-nologies公司聯(lián)合研制的第一臺微流控芯片商品“2100生化分析儀”就已經(jīng)開始投放市場,該系統(tǒng)使用CAliper公司生產(chǎn)的玻璃芯片,采用LIF進(jìn)行檢測,并配了5~6種試劑盒配合使用,可對DNA、RNA片段及蛋白質(zhì)等進(jìn)行電泳分離檢測,玻璃芯片尺寸為1.8cm&TImes;1.8cm,有效分離長度約1.6cm,30min可同時(shí)完成12個(gè)樣的分離檢測。與傳統(tǒng)的基因和蛋白質(zhì)電泳相比,芯片毛細(xì)管電泳無需樣品的走膠、染色、脫色工序,無需干燥和照相等煩瑣耗時(shí)的步驟,同時(shí)快速測試多個(gè)試樣,獲得基因和蛋白質(zhì)的電泳圖和曲線。整個(gè)測試過程簡化為快速、簡易的三個(gè)步驟:裝載樣品、進(jìn)行分析、觀察數(shù)據(jù)。


2、基因測序

  毛細(xì)管電泳的一個(gè)重要應(yīng)用領(lǐng)域是基因測序,正是因?yàn)?6根毛細(xì)管電泳陣列儀廣泛地應(yīng)用于人類基因組計(jì)劃的測序工作之中,才使舉世矚目的人類基因組計(jì)劃的進(jìn)程大大加快,使之由原定的2003年提前到2000年基本完成。事實(shí)上,從基因測序的原理來講,芯片毛細(xì)管電泳測序和普通毛細(xì)管電泳測序是完全一致的,但前者表現(xiàn)出了更大的優(yōu)越性:首先由于芯片毛細(xì)管電泳獨(dú)特的注樣方式和更細(xì)的分離通道,所以它能實(shí)現(xiàn)DNA的快速分離;另一方面微流控芯片采用了半導(dǎo)體工業(yè)中成熟的微加工技術(shù)進(jìn)行制造,所以一塊芯片上可以集成更多的毛細(xì)管,實(shí)現(xiàn)高通量測序;最后由于它實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)物處理和分析的集成化,減少了人為干擾,因此更進(jìn)一步地降低了操作成本。

  Mathies領(lǐng)導(dǎo)的研究小組早在1995年就開始在微流控芯片上開展了DNA測序工作,他們在一塊有效分離長度為3.5cm的芯片上測序了150個(gè)堿基,他們利用芯片變性毛細(xì)管電泳在10min之內(nèi)就完成了對433個(gè)堿基序列的測定。該測序芯片的毛細(xì)管長度為3.5cm,橫切面尺寸50μm&TImes;8μm。為了進(jìn)一步提高DNA測序能力,到2001年他們在直徑為150mm的圓形玻璃芯片上,刻蝕出了96個(gè)呈輻射型排布的毛細(xì)管電泳通道陣列,由于芯片采用旋轉(zhuǎn)掃描LIF法進(jìn)行檢測,所以可實(shí)現(xiàn)平行測序,測序達(dá)500堿基。


3、PCR反應(yīng)

 生化反應(yīng)芯片的功能就是把在普通實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)縮微到一塊小小的芯片上來完成。目前報(bào)道的生化反應(yīng)芯片主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerize Chain Reaction,PCR)芯片、藥物合成芯片等,其中PCR芯片是生化反應(yīng)芯片的典型代表。眾所周知,常規(guī)PCR需要制樣、擴(kuò)增及檢測等步驟,既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力,而當(dāng)用微流控芯片進(jìn)行PCR擴(kuò)增及相關(guān)檢測時(shí),則可大大簡化操作步驟、顯著提高檢測效率。1993年Northrup等人以硅片和玻璃為基質(zhì)材料首次報(bào)道了一種PCR芯片,并通過實(shí)驗(yàn)證明了PCR芯片可行性。該芯片的反應(yīng)室刻蝕在硅片中,體積約為幾微升,加熱器也直接集成在芯片上,與傳統(tǒng)的PCR相比,在相同擴(kuò)增效率下,該芯片的熱循環(huán)效率快2~ 10倍。為了進(jìn)一步提高PCR芯片的熱循環(huán)速度,Kopp M U等人發(fā)展了一種連續(xù)流動(dòng)式的PCR芯片,流動(dòng)式芯片下面有95℃、72℃、60℃三個(gè)不同的恒溫區(qū)間,當(dāng)樣品流經(jīng)它們時(shí)就會實(shí)現(xiàn)自動(dòng)變溫,在流動(dòng)中完成變性、退火和延伸反應(yīng),達(dá)到PCR擴(kuò)增的目的。

  另外,一旦把PCR芯片與毛細(xì)管電泳芯片二者集成起來的時(shí)候,其優(yōu)勢就顯得更為明顯。Lagally E T等人在玻璃芯片上制作了集閥門、疏水孔、PCR反應(yīng)池以及毛細(xì)管電泳(Capillary Elec-trophoresis,CE)于一體的芯片系統(tǒng),PCR反應(yīng)池體積是280nL,PCR擴(kuò)增前所需模板濃度為20拷貝/mL,反應(yīng)室中平均僅為5~6個(gè)DNA模板分子,加熱器和熱電偶集成在芯片的背面,10min即可完成20個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后,PCR反應(yīng)產(chǎn)物在電滲泵的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)入毛細(xì)管電泳芯片中,進(jìn)行在線CE分離分析。該芯片系統(tǒng)集取樣、PCR擴(kuò)增和CE分離于一體,節(jié)省了試劑消耗、加快了分析速度,同時(shí)也避免了實(shí)驗(yàn)操作中的人為污染。

編后語:目前,隨著玻璃微細(xì)加工技術(shù)和鍵合技術(shù)的發(fā)展成熟,這個(gè)問題開始得到解決,玻璃基微流控芯片將迎來發(fā)展機(jī)遇。

   “玻璃材料具有很好的電滲性質(zhì)和優(yōu)良的光學(xué)性質(zhì),無論是從其物理性質(zhì)還是化學(xué)性質(zhì)來講,都非常適合于微流控芯片的制作,但是它的光刻和蝕刻技術(shù)工藝復(fù)雜、費(fèi)時(shí),制作成本過高,這些因素制約了玻璃微流控芯片的應(yīng)用和推廣!

*聲明:該文觀點(diǎn)僅代表作者本人,成都邁科科技系信息發(fā)布平臺,成都邁科科技僅提供信息存儲空間服務(wù)。如果有任何異議,歡迎聯(lián)系成都邁科科技。


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